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L'équipe s'intéresse aux mécanismes de défense d'un organisme contre les agresseurs environnementaux et aux conséquences physiopathologiques lorsque ces mécanismes échouent. En nous concentrant sur les interactions hôte-pathogène, nous étudions la physiologie de l'intestin et les fonctions des cellules souches intestinales dans le maintien de l'homéostasie cellulaire et de l'immunité innée. Nos modèles biologiques sont Drosophila melanogaster et les bactéries du groupe Bacillus cereus, avec un intérêt particulier pour Bacillus thuringiensis qui est utilisé comme insecticide microbien en agriculture.

Contexte et Objectifs

Le groupe Bacillus cereus (Bc) est une famille de bactéries Gram-positives, anaérobiques facultatives et sporulantes, qui sont retrouvées de manière ubiquitaire dans l’environnement. Il comprend notamment les pathogènes Bc sensu stricto (Bc s.s.) et B. anthracis, ainsi que la bactérie B. thuringiensis (Bt) qui est largement utilisée dans le monde comme insecticide (2^ème insecticide le plus utilisé, incluant ceux de synthèse), que ce soit en agriculture biologique et conventionnelle, en sylviculture ou en démoustication. Bc s.s. est un agent pathogène opportuniste d'intoxication alimentaire provoquant des maladies de type diarrhéique (entérotoxines Nhe, Hbl et CytK) et/ou émétique (toxine céreulide). C'est la première cause de toxi-infections alimentaires collectives (TIAC) en France et en Europe. Certaines études ont aussi mis en évidence le potentiel mortel de Bc s.s. chez des personnes ayant un système immunitaire fragile.

Face aux sollicitations sociétales et gouvernementales, les insecticides Bt sont amenés à être de plus de plus utilisés en remplacement des insecticides chimiques, moins respectueux de l’environnement. Les bactéries du groupe Bc possèdent un cycle de vie à deux états : la cellule végétative capable de proliférer et la spore, forme dormante et résistante aux conditions environnementales défavorables. Bt est caractérisée par la production (d’origine plasmidique) d’un cristal protéique au cours de la sporulation. Ce cristal est composé principalement par les toxines Cry (endotoxines δ), qui confèrent à Bt son pouvoir entomopathogène. Après épandage, Les produits Bt contenant spores et cristaux de toxines sont ingérés par les larves des nuisibles. Les toxines Cry activées par des protéases digestives se lient à des récepteurs de l’épithélium intestinal (ALP, APN, cadhérines et transporteurs ABCC) et créent des pores, entrainant la mort de l’insecte (dit alors cible) par septicémie en 48-72h.

Les produits à base de Bacillus ont des applications variées. Ils sont prometteurs en tant qu'agents de biocontrôle, car de nombreux Bacillus spp. présentent des propriétés exploitables telles que la promotion de la croissance des plantes, l'activation des défenses des plantes, ainsi que la production d'antibiotiques, d'antifongiques et de toxines entomopathogènes. En outre, les souches de Bacillus sont également utilisées comme probiotiques pour les humains et les animaux. Cependant, la classification des membres du groupe Bc est complexe du fait de leurs caractéristiques très similaires et de leurs génomes hautement conservés. Les facteurs de virulence, ou à l'inverse les facteurs bénéfiques sont très mal connus. Les progrès en génomique suggèrent que Bt et Bc appartiennent à une seule espèce : Bc s.s.. La sécurité des insecticides Bt vis-à-vis de l’environnement et des humains est de plus en plus controversée. Des études récentes ont montré que plusieurs souches de Bt provenant de produits commerciaux ont été retrouvées dans des TIAC, suggérant que les insecticides Bt peuvent représenter un risque réel pour la sécurité alimentaire. De plus, la littérature ne présente pas de données fiables concernant les effets de l’ingestion chronique des produits Bt. Enfin, l'ingestion de spores, contrairement aux bactéries végétatives, a été peu étudiée et leur comportement et leurs impacts au niveau de l'intestin ne sont pas bien compris. Toutes ces données montrent qu’il reste beaucoup de connaissances à appréhender sur les bactéries du groupe Bc.

Notre équipe a pour objectif d'étudier les mécanismes d'homéostasie intestinale et de comprendre les réponses de l'hôte suite à l’ingestion de Bc/Bt/toxines selon plusieurs axes de recherche :

• signalisation et homéostasie intestinale

• virulence/modes d’action et réponse immunitaire

• physiopathologie intestinale

A - Spore of Bacillus thuringiensis ; B - 3D modelling of Cry toxins ; C - Apico-basal view of the Drosophila midgut ; D - Drosophila adult midgut ; E - Coomassie blue staining of Cry toxin ; F - Cross section of the Drosophila posterior midgut ; G - Longevity curves of adult Drosophila ; H - Cell counting in the Drosophila midgut.

Modèles biologiques

Notre modèle d’étude est Drosophila melanogaster (The Interactive Fly) (Flybase) qui nous permet de combiner des approches de génétique, de biologie cellulaire et moléculaire et de physiologie, ainsi que des outils omiques et bioinformatiques . La drosophile est un modèle d’insecte non-cible aux produits Bt et permet donc de déceler des changements physiologiques sur le long terme, non létaux mais potentiellement indésirables, qui seraient beaucoup plus difficilement mis en évidence par des approches toxicologiques et épidémiologiques classiques. De plus, la grande conservation des principaux mécanismes physiologiques et des voies de signalisation entre la drosophile et les vertébrés permet de transposer rapidement les résultats à d'autres animaux.

En plus de posséder des propriétés pathogènes, les bactéries du groupe Bc (Bacillus Genetic Stock Center) présentent des propriétés variées qui sont exploitées pour la stimulation de la croissance des plantes, l'activation des défenses des plantes, ainsi que la production d'antibiotiques, d'antifongiques et de toxines entomopathogènes. Elles sont également utilisées dans la santé humaine et vétérinaire comme probiotique. Toutes ces propriétés sont mal étudiées. Dans notre équipe, nous utilisons diverses souches de Bc/Bt et mutants associés, ce qui nous permet d’avoir un éventail d’outils pour une étude approfondie.

Originalité scientifique de l’équipe

Notre équipe est la première à développer des recherches systématiques sur les effets non intentionnels des insecticides Bt en combinant deux disciplines éloignées: l'Ecotoxicologie et la Biologie Cellulaire et du Développement. Ceci est notamment permis grâce à utilisation de la drosophile. Nous avons ainsi la possibilité de réaliser simultanément :

1. une approche finalisée, en étudiant les impacts physiologiques et physiopathologiques des insecticides Bt et de ses toxines                                                                                                                                                                                                                    
2. une approche fondamentale permettant l'identification des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués et impactés.

Collaborations

Nous avons établi des collaborations interdisciplinaires avec des équipes travaillant sur les modèles Drosophila et souris, ainsi qu'avec des laboratoires hospitaliers et de sécurité alimentaire. Ces collaborations permettent de compléter nos approches afin de donner une vue plus globale des impacts que les spores Bt/Bc pourraient avoir sur la santé et l'environnement.

• équipe " Virulence microbienne et signalisation inflammatoire" de Laurent BOYER (C3M, Nice)

• équipe "Bacillus & Clostridium" d’Olivier FIRMESSE et Mathilde BONIS (Anses, Maisons-Alfort)

• équipe "Mucosal microbiota in chronic inflammatory diseases" de Benoit CHASSAING (Institut Cochin, Paris)

• laboratoire de bactériologie de Raymond RUIMY (CHU de l'Archet II, Nice)

• équipe "Chromatine et Biologie Cellulaire - Dynamique du génome" de Giacomo CAVALLI (IGH, Montpellier)

• équipe "Stem cell immunity and vibrio pathogenesis" d'Edan FOLEY (University of Alberta, Canada)

• équipe "Mécanismes mOléculaires et Cellulaires des Agents biologiques infectieux (MOCA)" de Dani OSMAN (PIMT, La Réunion)

• équipe "Interaction hôte-pathogène dans le modèle de la drosophile" de Julien ROYET (IBDM, Marseille)

Projets

I – Virulence/modes d’action de Bt/Bc/toxines et réponse immunitaire de l’hôte

I-1. Virulence de Bt/Bc

En collaboration avec l’équipe "Bacillus & Clostridium" d’Olivier FIRMESSE et Mathilde BONIS (Anses, Maisons-Alfort)

I-1.1 Implications de Bt dans les TIAC

Bt ne fait actuellement l’objet d'aucun critère réglementaire de sécurité des aliments en France comme en Europe, alors que Bc est impliquée dans de nombreuses TIAC. L’Anses et l’autorité de sécurité alimentaire européenne (EFSA) soulignent la probable sous-estimation de l'implication de Bt dans les TIAC (Bt et Bc n’étant pas différenciées par les laboratoires de microbiologie), et des effets à long terme sur l'environnement et la santé.

Une analyse rétrospective récente sur 250 épisodes de TIAC associées au groupe Bc, menée par L'Anses, a révélé la présence de Bt dans 20% des cas, et dans 8% des cas, Bt est le seul microorganisme détecté. Plus de 95 % des Bt identifiées n’étaient pas distinguables de certaines souches d’usage commercial, suggérant une origine agricole des contaminations (Bonis M. et al., 2021. Comparative phenotypic, genotypic and genomic analyses of Bacillus thuringiensis associated with foodborne outbreaks in France. PLoS One). Une collaboration a eté initiée entre nos deux équipes pour utiliser le modèle drosophile afin d’évaluer et comparer in vivo le caractère pathogène des différentes souches Bt (TIAC et produits commerciaux). De plus, nous développons des expériences permettant l'étude de la perméabilité intestinale, ainsi que la détection et la quantification des symptômes de type gastro-intestinaux (diarrhée/vomissement). Ces approches nous permettront d'évaluer le potentiel de virulence d'une souche donnée en lien avec sa capacité à induire des intoxications alimentaires.

II-1.2. Recherche in silico des facteurs de virulence et étude in vivo de leur expression/fonction

Cette partie consiste à rechercher les marqueurs de virulence associés à Bt/Bc, par analyse des génomes complets de 50 souches sélectionnées et additionnées d’une trentaine de génomes publiques d’intérêt. En parallèle, nous réalisons une analyse de transcriptome bactérien in vivo dans l'intestin de drosophile. Le niveau d'expression de tous les gènes bactériens sera mis en regard de la virulence. Ainsi, l’ensemble du projet décrit dans cette partie apportera un éclairage sur l’implication de Bt/Bc dans les TIAC et sur les causes de virulence (facteurs de virulence, expression et fonction).

I.2. Réponse immunitaire de l’hôte

En collaboration avec l'équipe " Virulence microbienne et signalisation inflammatoire" de Laurent BOYER (C3M, Nice), l’équipe "Bacillus & Clostridium" d’Olivier FIRMESSE et Mathilde BONIS (Anses, Maisons-Alfort) et le laboratoire de bactériologie de Raymond RUIMY (CHU de l'Archet II, Nice).

Chez la drosophile et la souris, nous avons montré que les spores du groupe Bc persistaient jusqu'à 10 jours dans l'intestin (Hachfi S. et al., 2023. Ingestion of Bacillus cereus spores dampens the immune response to favor bacterial persistence. bioRxiv. https://biorxiv.org/cgi/content/short/2023.03.16.532769v1). De plus, nous montrons dans les deux modèles que l'ingestion des spores ne déclenche pas de réaction de défense dans la partie antérieure de l'intestin (siège d'une réponse immunitaire forte et efficace), à la différence des bactéries végétatives. En conséquence, les spores atteignent la partie postérieure où la réponse immunitaire est limitée, et y germent. Ce processus biologique est retrouvé chez la drosophile et la souris, révélant une forte conservation de la réponse intestinale à l’ingestion de spores.

Nous poursuivons cette étude en analysant le type de réponse immunitaire innée intestinale et les moyens de défense mis en place par l'hôte. Pour cela, nous avons réalisé une analyse transcriptomique à différents temps (4h jusqu’à 10 jours) post-ingestion (96 échantillons ; en collaboration avec la plateforme de bioinformatique de notre institut et la plateforme France Génomique de Sophia Antipolis). Nous poursuivons la validation d’un certain nombre de gènes/voies de signalisation potentiellement intéressants et l’analyse de leurs fonctions dans la réponse immunitaire mise en place après germination.

I.3. Mode d’action des toxines Cry et récepteurs chez les organismes non-cibles

L’équipe a observé que les insecticides Bt augmentaient significativement le nombre de cellules entéroendocrines (EEC) au détriment de l'apparition de nouveaux entérocytes (EC) (Jneid R. et al., 2023. Bacillus thuringiensis toxins divert progenitor cells toward enteroendocrine fate by decreasing cell adhesion with intestinal stem cells in Drosophila. eLife). La force et la durée de l'adhésion cellulaire, notamment via les jonctions adhérentes Cadhérine-dépendantes, entre cellules souches intestinales (ISC) et progéniteurs, sont importantes pour définir le devenir cellulaire des progéniteurs. Nos résultats indiquent que les toxines Cry1A interfèrent avec l'adhésion intercellulaire ISC-progéniteur, entrainant une activation trop faible de la voie de signalisation Notch et poussant les progéniteurs à se différentier en EEC plutôt qu'en EC. Nous voulons maintenant identifier les protéines intestinales cibles des toxines Cry1A (immunoprécipitation et spectrométrie de masse). Une fois les protéines cibles identifiées, nous validerons leur implication fonctionnelle in vivo en utilisant les outils génétiques de la drosophile (mutant, ARNi, surexpression), ce qui permettra de comprendre le mode d'action nocif des toxines Cry1A.

II – Spores Bt et physiopathologies intestinales

En collaboration avec l’équipe "Mucosal microbiota in chronic inflammatory diseases" de Benoit CHASSAING (Institut Cochin, Paris)

L’impact d’une ingestion chronique d’aliments contenant Bt sur des organismes adultes non-cibles n’a pas été étudié. Notre équipe a développé un protocole exposant les animaux via leur nourriture à une dose qui correspond à la quantité de spores Bt appliquée sur le terrain. Utilisant ces conditions d’élevage, nos objectifs sont d’évaluer l’impact de l’ingestion de Bt sur la physiologie intestinale et le développement de pathologies 1) inflammatoires (type maladie de Crohn, colite ulcéreuse), 2) métaboliques (syndrome métabolique) et 3) tumorales (cancer colorectal). Ces expériences sont effectuées sur des adultes sains. Cependant, l’ingestion chronique de Bt, même à faible dose, pourrait être un facteur d’aggravation du risque de développer les physiopathologies intestinales chez des individus fragiles. Ainsi, les conditions de prédisposition génétique (inflammatoire, tumorale), d’immaturité (individus jeunes) et de vieillissement (individus âgés) seront également testées.

II.1. Maladies inflammatoires

Nous évaluons ici les impacts de l'ingestion chronique de Bt chez les mouches adultes en bonne santé en utilisant des tests de longévité et des marqueurs de la structure/physiologie/vieillissement de l'intestin. En particulier, nous analysons les altérations cellulaires de l'intestin (perméabilité, dommages oxydatifs, dysplasie, inflammation), qui sont des symptômes récurrents des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI). Ensuite, nous évaluerons de la même manière l'impact que pourrait avoir les produits Bt sur des individus à risque (prédisposition dans les voies inflammatoires). Enfin, le rôle joué par le microbiote intestinal sera évalué.

Afin de déterminer les réponses cellulaires induites, nous avons réalisé une analyse du transcriptome intestinal. L’ensemble de ce projet nous permettra par conséquent d’examiner si l'ingestion chronique d'aliments traités avec Bt peut favoriser l'apparition ou le développement de MICI, ce qu'aucune autre étude n'a encore regardé.

II.2. Maladies métaboliques

L'augmentation du nombre d'EEC sécrétrices d’hormones peptidiques par les toxines Cry1A (Jneid R. et al., 2023. Bacillus thuringiensis toxins divert progenitor cells toward enteroendocrine fate by decreasing cell adhesion with intestinal stem cells in Drosophila. eLife) pourrait avoir des conséquences délétères sur le maintien de l'homéostasie cellulaire intestinale, le comportement alimentaire, le métabolisme, et cela tout particulièrement chez des individus prédisposés à développer des physiopathologies intestinales. Nous voulons poursuivre cette étude en mesurant la bioénergétique cellulaire (sucre, lipides, respiration…) afin d'évaluer les paramètres métaboliques qui sont affectés par l'ingestion de Bt. De plus, les outils disponibles chez la drosophile nous permettront une analyse de différents processus tels que la prolifération des ISC, la mauvaise différenciation des précurseurs, la dysplasie, le vieillissement ou encore le comportement alimentaire. Ces travaux permettront d'identifier les facteurs produits en excès (ou en insuffisance) par le surnombre d’EEC et impliqués dans l'apparition des symptômes associés à l’ingestion de Bt.

II.3. Maladies tumorales

L’état pro-inflammatoire induit par l’ingestion de Bt pourrait favoriser l’apparition de maladies comme les cancers. Cette partie du projet aura pour objectif d’étudier le rôle d’une intoxication bactérienne de Bt dans le développement de cancers intestinaux chez des individus à risque.

III - Homéostasie intestinale

En collaboration avec l'équipe "Chromatine et Biologie Cellulaire - Dynamique du génome" de Giacomo CAVALLI (IGH, Montpellier) et l'équipe "Stem cell immunity and vibrio pathogenesis" d'Edan FOLEY (University of Alberta, Canada)

La famille du groupe Polycomb (PcG) est impliquée dans la régulation négative de l’expression génique et est composée notamment des complexes PRC1 et PRC2 (« Polycomb Reppressive Complex »). PRC1 agit en général avec le complexe PRC2, et provoque la compaction de la chromatine des promoteurs géniques. De par ce rôle dans le remodelage de la chromatine, les protéines PcG sont importantes dans le développement et l’homéostasie de nombreux tissus, et en particulier au niveau des cellules souches. Ainsi, Bmi1 du complexe PRC1 est impliqué dans le renouvellement des cellules souches et dans l’apparition de cancers humains. Il a été récemment montré que, chez la souris, PRC1 était crucial pour le renouvellement des ISC. Notre objectif est de caractériser le rôle de PRC1 et PRC2 dans l’intestin de drosophile. Les questions importantes à résoudre sont : PRC1/PRC2 jouent-ils un rôle dans les ISC, et si oui, lequel ? PRC1/PRC2 jouent-ils un rôle dans les autres types cellulaires (lignée EC, lignée EEC) ? Quels sont les membres des complexes PRC1/PRC2 impliqués ? Quels sont les gènes cibles de PRC1/PRC2 ?

L’ensemble de ces résultats permettra de mieux comprendre les mécanismes épigénétiques contrôlant la prolifération et la différenciation des ISC chez la drosophile. Ils devraient également permettre de faire le parallèle avec le complexe PRC1 des mammifères, qui lui permet de maintenir l’état indifférencié des ISC.

ISC = intestinal stem cell; EB = enteroblast; EC = enterocyte; EEP = enteroendocrine precursor; EEC = enteroendocrine cell; Classes I and II: hormone peptides

Conclusion

L’ensemble des travaux de l’équipe permettent d’évaluer les réponses de l’ingestion des spores du groupe Bc au niveau de l’intestin, d’élucider les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents, et d’analyser les conséquences sur l’organisme entier. Ils permettront également de renforcer les connaissances fondamentales sur la relation entre les bactéries allochtones sporulées, largement présentes dans l’environnement, la physiologie intestinale et la santé. Le modèle drosophile permettra d'évaluer l'impact des insecticides Bt sur la santé des insectes, qui représentent 85% de la biodiversité animale et dont nous connaissons l’importance pour la santé des plantes (et donc pour l’environnement).