CODICOUNT

Ce  plugin a été développé dans le cadre du projet ANR TriPTIC (2014-2019) et du projet INRA (SPE) PHENOMENE (2017-2019).

Contact: Vincent Calcagno vincent.calcagno@irnae.fr et Guy Perez guy.perez@inrae.fr  

• Lien de téléchargement : http://sites.imagej.net/Cvince/

Installation

Première étape : Installer R

Deuxième étape (sous Windows uniquement) : Mettre à jour le PATH 

• Tapez « variables d’environnement » dans la barre de recherche du système.
• Modifiez les variables d’environnement, cela vous redirigera vers le panneau des propriétés système.
• Cliquez sur « Variables d’environnement ». 
• Dans la fenêtre qui s'ouvre, modifiez la variable Path. Sélectionnez Path, puis cliquez sur « Modifier ». Ensuite, cliquez sur « Nouveau », puis « Parcourir », et recherchez le dossier R (par exemple : C:\Program Files\R\R-4.4.2). Sélectionnez le dossier bin et validez avec « OK ».

Troisième étape : Installer le plugin codicount.jar

• Téléchargez la dernière version du fichier codicount.jar 
• Copiez-le dans le dossier plugins qui se trouve à l’intérieur du dossier Fiji ou ImageJ.
• Redémarrez Fiji ou ImageJ. CODICOUNT devrait maintenant apparaître dans le menu "Plugins".

Tutoriel

Guide d'utilisation pas à pas 

Une fois le plugin installé, et des images à compter disponibles, voici une description pas-à-pas des étapes à suivre dans ImageJ/FIJI

1- Identification de la zone à compter dans les images.

Il faut commencer par identifier les zones que nous souhaitons compter dans les images, en excluant les éventuels éléments parasites (bords de tubes, morceaux de coton, étiquettes portant le numéro d'échantillon, doigts...). Pour cela le plus simple est d'ouvrir les images puis les découper (« Crop »). Si la zone à compter est de forme carrée ou rectangulaire, on sélectionne la zone avec l'outil de sélection « Rectangular ». On clique après sur le bouton gauche de la souris tout en maintenant la touche « Maj » enfoncée pour définir la zone à compter. Une fois le bouton de la souris est relâché, on peut ajuster cette zone en déplaçant le cadre de sélection ou en modifiant sa taille. Une fois la zone correctement délimitée, on utilise la commande « Image, Crop ».

Finalement,on peut enregistrer l’image redécoupée. Une autre approche consiste à indiquer au logiciel des zones à ignorer. Ceci est particulièrement utile lorsque la zone à compter à une forme plus complexe (disque, ovale...). Il s'agit alors de colorier toutes les zones à ignorer avec des pixels ayant exactement la couleur (r, g, b) suivante : (255, 0, 182).

On peut par exemple utiliser le pinceau « Paintbrush tool ». Les pixels ayant cette valeur seront complètement ignorés au moment du comptage ; il est alors inutile de découper l'image. Il faut au préalable spécifier la couleur, ce qui se fait via le menu « Image > Color > Color Picker... ». On double clique dans le carré en bas à gauche de la fenêtre Color Picker. Une nouvelle fenêtre « Foreground Color » apparaît, dans laquelle on peut modifier les valeurs (r,g,b).

Évidemment, le plus simple consiste encore, dès la prise de vue, à ne cadrer que la zone à compter, afin d'avoir des images directement utilisables pour le comptage.

2- Calibration du plugin pour les images à compter.

Cette étape permet d'apprendre au plugin le type d'images qu'il va devoir traiter, afin qu'il détermine la meilleure façon de procéder. A l'issue de cette étape, le plugin produit une macro ImageJ qui pourra être utilisée pour compter les images de ce type. Il faut créer une macro par type d'image (couleur du fond, éclairage, exposition, espèces d'hôtes et de trichogrammes, âge des œufs...) afin de garantir une bonne performance.A partir d'une image d’œufs sur un fond de couleur, il va s'agir de donner au plugin des échantillons de pixels correspondant aux différentes zones à distinguer. Il faudra donc sélectionner trois zones : fond, œufs sains, œufs parasités, qui devront être nommées respectivement Background, Healthy et Parasitized. Pour ce faire, la meilleure méthode est de sélectionner l'outil «Oval » avec le bouton droit de la souris pour accéder à l'outil de sélection « Selection Brush tool ». Un double clic gauche sur le bouton permet d'ajuster la taille de la zone de sélection, qui ne doit être ni trop petite ni trop grande par rapport à la taille des œufs, ce qui facilitera la sélection.

Grâce à cet outil, on va tout d'abord sélectionner des zones appartenant au fond (ne comportant donc n pas d’œuf). Il faut essayer d'obtenir un échantillon de pixels qui soit le plus représentatif possible de la couleur du fond. On peut sélectionner plusieurs zones disjointes bien évidemment, en maintenant la touche « Maj » enfoncée lors de la sélection.

Une fois l’ensemble des pixels sélectionnés, on va mémoriser cette sélection dans le ROI Manager, en utilisant « Edit > Selection > Add to Manager » dans le menu, soit en utilisant le raccourci claver « Crtl + T ». Une fenêtre intitulée « ROI Manager » s’ouvrira, et la sélection apparaît avec un nom arbitraire choisi par ImageJ. On renomme donc cette ROI « Background » en utilisant le bouton « Rename ». Notez que seule la première lettre du nom (« B ») est nécessaire, la suite est facultative.

On désélectionne alors tous les points correspondant au fond en appuyant simultanément sur les touches « Crtl + Maj + A», ou en suivant le cheminement « Edit, Selection, Select None ».L'opération peut alors être répétée pour sélectionner des pixels correspondant aux œufs sains (ROI à renommer « Healthy ») et parasités (ROI à renommer « Parasitized »). Il est inutile ici de chercher à sélectionner précisément des œufs en entier.

Il est en revanche important lors des sélections de veiller à prendre des points représentant toutes les zones de l’image (une quarantaine de points environ pour le fond, les œufs sains et les œufs noirs, répartis uniformément sur l'ensemble de l'image). Il faut aussi veiller à sélectionner tous les types de pixels que l'on trouve dans chacune des zones. Par exemple, si il y a des ombres portées sur le fond, il faut aussi les inclure dans la sélection « Background », afin que le plugin sache bien que les ombres appartiennent au fond, et optimise ainsi la discrimination.

Lorsque l'on a un grand nombre d'images du même type à compter, l'idéal est de faire une calibration à partir de plusieurs des images, afin d'obtenir des réglages adaptés à l'ensemble des images, et non pas spécialisés sur une des images. Pour ce faire, il suffit de faire un montage de plusieurs images. Il suffit d'ouvrir plusieurs des images, par exemple en utilisant le menu « File > Import > Image sequence ».

Une fois toutes les images souhaitées sont ouvertes, on peut en créer un montage, via le menu « Image > Stacks >Make Montage ».

Dans la fenêtre « Make montage » qui s’ouvre, la valeur par défaut de « scale factor » est de 0,25. Il faut la mettre à 1 (sinon ceci affecterait la calibration de la taille des oeufs, le cas échéant), puis cliquer sur « ok ». Un montage de toutes les images est ainsi créé, et sur cette image la calibration peut être faite selon la procédure décrite précédemment.Si jamais vous exécutez CODICOUNT sans avoir créé les trois Rois nécessaires, le programme va créer pour vous trois zones vides nommées comme il le faut B, H et P. Il ne vous reste plus alors qu'à les mettre à jour avec les zones d'images correspondantes (utilisez le bouton « Update » dans le ROI Manager).

3- Calibration de la taille des œufs (Optionnel)

Toujours sur la même image, il est aussi possible d'indiquer au plugin la taille des œufs à compter. Il

faut pour cela sélectionner l'outil « Freechand selections », entourer un ou plusieurs œufs (si possible bien isolés sur le fond), et ajouter la zone comme sélection dans le ROI Manager (« Crtl + T » comme n précédemment). La zone créée doit alors être nommée en fonction du nombre d'oeufs présents dans la zone (1,2,3, ...). Par exemple : si on entoure un seul œuf, on nomme la ROI « 1 » dans le ROI Manager, si on entoure 7 œufs on la renomme « 7 », etc...

Il est inutile de compter l'ensemble de l'image, mais l’idéal est encore une fois d’avoir plusieurs zones représentatives de la distribution de taille des œufs.

4- Génération de la macro de comptage

Une fois toutes ces informations mémorisées dans ROI Manager, on peut faire appel au plugin « CODICOUNT » disponible dans le menu déroulant de « Plugins ». Il peut être utile d’enregistrer les zones sélectionnées dans le ROI Manager, en utilisant « More > Save ». Cela permet de garder trace de la calibration du plugin, pour pouvoir la répéter ultérieurement.

Suite à l’exécution du plugin (quelques secondes), une fenêtre s’ouvre nommée « Log », dans laquelle se trouve écrit le code de la macro, qui pourra être utilisée pour compter les différentes images. Cette macro contient différentes informations (dont sa date de création et le nom de l'image qui a servi à la calibration). Le texte de la macro commence par //CODICOUNT et se termine par //End of macro.

Il est utile de la sauvegarder afin de pouvoir la réutiliser ultérieurement, et de garder une trace des analyses faites. Le contenu de la macro peut être copié-collé depuis la fenêtre Log. Il suffit de créer une nouvelle fenêtre de macro, via « Plugins > New > Macro », dans laquelle on colle le texte de la macro. A la fin de cette opération, on peut enregistrer la macro (« File > Save As... » ).

5- Comptage d'une ou plusieurs images

Vous allez pouvoir maintenant mettre en application le comptage automatique des images, enexécutant la macro générée par le plugin (« Macro > Run » dans la fenêtre de la macro, ou raccourciclavier « Ctrl + R »). Pour exécuter une macro qui a été préalablement sauvegardée sur le disque, ilsuffit d'utiliser « Plugins > Macros > Run... ».

Après exécution de la macro, deux choses se produisent. Premièrement, une nouvelle image apparaît, correspondant à l'image telle que le programme l'a vue : les oeufs sains sont représentés en jaune, les oeufs parasités en noir.

Deuxièmement, la fenêtre des résultats apparaît sur l’écran, avec les colonnes suivantes :

• Image : correspond au nom de l’image
• Total surface : nombre de pixels total (à l'exclusion des pixels de couleur (255, 0, 182))- la colonne B : « Background », nombre de pixels du fond
• la colonne H : « Healthy », nombre de pixels des œufs sains
• la colonne P : « Parasitized », nombre de pixels des œufs parasités
• la colonne #H (si la taille des oeufs a été calibrée) : nombre d’œufs sains
• la colonne #P (si la taille des oeufs a été calibrée) : nombre d’œufs parasités
• la colonne %P est le pourcentage d’œufs parasités (taux de parasitisme).

Lorsque l'on a beaucoup d'images à compter, la macro peut bien sûr être exécutée sur chaque image individuellement, mais la méthode la plus efficace consiste à l'appliquer en bloc sur un dossier entier d'images. Pour ce faire vous devez cliquer sur « Process > Batch > Macro » une fenêtre batch process s’ouvre, vous devez sélectionner le dossier « Imput » dans lequel se trouve les images puis vous sélectionnez le dossier cible « output » dans lequel seront stockées les images analysées. On clique après sur « Open » pour ouvrir la fenêtre contenant la macro. On choisit la macro et on valide par « ok » pour l’installer dans le batch process. En fin de cette procédure, vous cliquez sur « Process » pour lancer l’opération de comptage. Les résultats seront alors présentés sous forme d'un tableau (une ligne par image comptée) qui apparaît sur l’écran.

Les résultats peuvent être enregistrés au format Excel pour analyses statistiques.